后端对比指南

gmlst 提供多个比对后端，因为 MLST 和 cgMLST 的工作负载并不相同。有的场景更看重组装基因组上的最高置信度，有的场景需要直接处理 FASTQ 原始读段，还有的场景追求超大方案上的最高吞吐量。选什么后端，主要取决于输入类型、方案规模，以及你更在意灵敏度、速度还是读段映射行为。

可以先按这个思路选。组装基因组想走经典参考路径，用 blastn。FASTQ 分型想要稳妥的常规后端，用 kma。大规模 cgMLST 追求速度，用 minimap2。如果样本和等位基因差异较大，或者是非标准物种，用 nucmer。

后端对比表

名称	输入类型	速度	灵敏度	最适合的场景	外部工具
blastn	FASTA	中等	最高	参考型 MLST、结果验证、组装基因组	blastn, makeblastdb
kma	FASTA, FASTQ	快	高	FASTQ 分型、常规 MLST、基于读段的 cgMLST	kma
minimap2	FASTA, FASTQ	很快	高	大型 cgMLST、高通量分型、快速 FASTA 流程	minimap2（某些 FASTQ 临时输出在可用时会配合 samtools）
nucmer	FASTA	中等	对远缘序列非常高	远缘菌株、跨物种比对、分歧较大的等位基因	nucmer, show-coords

如何选择

场景	推荐后端	原因
小规模或常规组装基因组 MLST	blastn	经典路径，置信度高，行为直观
FASTQ MLST 或 FASTQ cgMLST	kma	直接支持双端读段，读段映射流程成熟
大型 FASTA cgMLST	minimap2	吞吐量最高，还有多种加速机制
想在 FASTQ 上先快速筛选，再做定点确认	minimap2	两阶段 FASTQ 路径兼顾速度和确认
序列差异较大或非标准物种	nucmer	对远缘匹配更敏感
快速跑完后再做复核	blastn	很适合作为第二遍确认后端

BLASTN (blastn)

blastn 是组装基因组场景下最稳妥的参考后端。它只接受 FASTA 输入，使用 BLAST+ 数据库流程，因此很适合做基准分型、结果复核，或者作为其他快速后端的对照。

适用场景

• 组装基因组上的参考型 MLST
• 快速流程后的验证
• 更看重灵敏度而不是极致速度的任务
• 边界等位基因调用，需要经典比对路径复核的样本

示例命令

# 组装基因组上的标准 MLST
gmlst typing mlst -s saureus_1 -b blastn sample.fasta

# 多线程批量分型
gmlst typing mlst -s saureus_1 -b blastn -t 8 samples/*.fasta -o results.tsv

# 对标记样本做定向 cgMLST 复核
gmlst typing cgmlst -s vparahaemolyticus_3 -b blastn flagged_sample.fasta

说明

• 输入类型：仅 FASTA
• 建索引工具：makeblastdb
• 线程支持：支持 -t/--threads
• 最适合：组装基因组上的高置信度分型

性能建议

• 方案较大时建议使用 -t。
• 批量运行时建议配合 -o 直接写文件。
• 对大型 cgMLST 来说，blastn 更适合作为回退后端或复核后端，而不是所有样本的第一遍主流程。

KMA (kma)

kma 是 FASTQ 分型最实用的通用后端。它既支持 FASTA，也支持 FASTQ，但真正的优势在于直接处理读段、双端输入，以及日常生产环境中的稳定表现。

适用场景

• FASTQ MLST 或 cgMLST
• 需要直接处理双端读段的样本
• 重视速度与稳定映射行为的常规流程
• 更偏好 KMA 行为而不是 minimap2 候选打分路径的 cgMLST 任务

示例命令

# 双端读段 MLST
gmlst typing mlst -s saureus_1 -b kma reads/sample_R1.fastq.gz reads/sample_R2.fastq.gz

# FASTQ cgMLST
gmlst typing cgmlst -s vparahaemolyticus_3 -b kma -t 8 reads/sample_R1.fastq.gz reads/sample_R2.fastq.gz

# 用 KMA 处理 FASTA
gmlst typing mlst -s saureus_1 -b kma sample.fasta

FASTQ 行为

• gmlst 会自动识别常见的双端命名，例如 _R1/_R2、_1/_2、.1/.2。
• 对 FASTQ cgMLST，CLI 可以通过 GMLST_CGMLST_FASTQ_KMA_AUTO_THREADS 自动把线程数从 1 提高到更合理的值。
• GMLST_CGMLST_KMA_FASTQ_MEM_MODE=1 会启用 KMA 的 -mem_mode，让第一遍映射更快。
• GMLST_CGMLST_KMA_FASTQ_MEM_CONFIRM_MAX_LOCI 控制后续严格复查阶段，最多对若干个 closest 位点重新确认。

说明

• 输入类型：FASTA 和 FASTQ
• 建索引工具：KMA index
• 线程支持：支持 -t/--threads
• 最适合：FASTQ cgMLST 和基于读段的常规分型

性能建议

• 大型 cgMLST 不要长期使用 -t 1，速度会明显下降。
• 想要日常 FASTQ 流程更快，可以保留 GMLST_CGMLST_KMA_FASTQ_MEM_MODE=1。
• 如果更看重严格确认，可以调大 GMLST_CGMLST_KMA_FASTQ_MEM_CONFIRM_MAX_LOCI。

minimap2 (minimap2)

minimap2 是大规模 cgMLST 的高吞吐后端。它同时支持 FASTA 和 FASTQ，但两种输入走的是不同路径。

对 FASTA 组装结果，gmlst 会使用快速的等位基因到基因组路径，并可叠加精确哈希预判、代表序列预过滤、自适应补救和速度档位。对 FASTQ 读段，则使用两阶段流程，先生成候选，再对不确定位点做定向重映射验证。

适用场景

• 大型 FASTA cgMLST
• 高通量批处理
• 需要快速候选筛选加定向确认的 FASTQ 分型
• 想使用 chewBBACA 风格 cgMLST 模式的 FASTA 工作流

示例命令

# FASTA cgMLST，默认后端就是 minimap2
gmlst typing cgmlst -s vparahaemolyticus_3 sample.fasta

# 显式指定 minimap2，并使用 chew 兼容模式
gmlst typing cgmlst -s vparahaemolyticus_3 -b minimap2 --cgmlst-mode fast sample.fasta

# FASTQ 分型，使用 minimap2 候选生成加定向验证
gmlst typing mlst -s saureus_1 -b minimap2 reads/sample_R1.fastq.gz reads/sample_R2.fastq.gz

# 面向大规模 cgMLST 的 ultrafast 调优
GMLST_MINIMAP2_FASTA_SPEED_PROFILE=ultrafast \
gmlst typing cgmlst -s vparahaemolyticus_3 -b minimap2 --cgmlst-mode ultrafast samples/*.fasta -o cgmlst.tsv

FASTA 路径

大部分 minimap2 的 cgMLST 加速都发生在 FASTA 路径上。

• GMLST_MINIMAP2_FASTA_SPEED_PROFILE=default|fast|ultrafast 控制 minimap2 的速度档位。
• GMLST_CGMLST_EXACT_HASH_PREFILTER=1 启用 DNA 精确匹配预判。
• GMLST_CGMLST_MINIMAP2_HASH_PREFILTER=1 启用哈希优先的候选缩减。
• GMLST_CGMLST_PREFILTER_MAX_LOCI 控制方案过大时是否自动跳过预过滤。
• GMLST_CGMLST_MINIMAP2_HASH_REFINE_MAX_LOCI 控制缺失位点的二次精修上限。
• GMLST_CGMLST_MINIMAP2_HASH_LOCI_TOP_N 控制哈希阶段保留的位点数量。
• GMLST_CGMLST_MINIMAP2_REPRESENTATIVE_MAIN_ALIGNMENT=1 启用代表序列主比对，适合极致速度模式。
• GMLST_MINIMAP2_FASTA_EMIT_CIGAR=0 可关闭 FASTA CIGAR 输出，减少速度导向路径中的额外开销。

FASTQ 路径

FASTQ 路径分两步。

1. 根据读段比对结果生成候选，并做 k-mer 支持打分。
2. 对不确定位点执行定向重映射验证，再输出最终等位基因调用。

相关参数：

• GMLST_MINIMAP2_KMER_ENGINE=python|kmc|auto，控制 k-mer 支持打分引擎。
• auto 会在 KMC 可用时优先使用 KMC，否则退回内置 Python 打分器。
• 如果系统安装了 samtools，定向验证阶段可以写出 BAM 临时文件。
• GMLST_TMPDIR 用来控制临时文件目录。

chewBBACA 兼容模式

typing cgmlst 支持下列模式值：

模式	常见用途
fast	更快的 chew 风格流程，包含 exact-hash、hash prefilter、refinement 和 fallback
ultrafast	面向 FASTA 的最高吞吐模式，带代表序列主比对和二次补救
balanced	在速度和确认之间取中间值

要注意，这些 chew 风格优化主要针对 FASTA。对于 FASTQ 输入，typing cgmlst 会自动把 -b minimap2 调整为 -b kma，--cgmlst-mode 只保留兼容意义。

证据回退

低置信度位点可以发送到指定回退后端进一步确认。

• GMLST_CGMLST_EVIDENCE_FALLBACK_BACKEND=none|blastn|kma|nucmer
• GMLST_CGMLST_EVIDENCE_FALLBACK_MAX_LOCI=<int>

这个机制很适合让 minimap2 负责主流程吞吐，再让少量不确定位点交给更保守的后端确认。

MUMmer4 / nucmer (nucmer)

nucmer 是面向 FASTA 组装结果的高敏感后端，特别适合序列分歧较大的情况。对于非标准物种、远缘样本、或者跨物种探索分析，这个后端通常比常规 MLST 场景更有价值。

适用场景

• 差异较大的组装基因组
• 非标准物种或探索性分析
• 关注敏感匹配而不是经典参考行为的跨物种比较

示例命令

# 对分歧较大的组装结果做敏感 MLST
gmlst typing mlst -s saureus_1 -b nucmer sample.fasta

# 对困难样本做 cgMLST 复核
gmlst typing cgmlst -s vparahaemolyticus_3 -b nucmer flagged_sample.fasta

说明

• 输入类型：仅 FASTA
• 建索引工具：nucmer reference index 流程
• 线程支持：相对有限，gmlst 也会提示线程设置可能被忽略
• 最适合：分歧较大序列的敏感回退分析

后端选择建议

快速决策表

你的输入或需求	推荐后端	原因
组装基因组，想要最终参考结果	blastn	经典路径，置信度高
双端 FASTQ 读段	kma	直接读段映射，日常流程表现稳
数千位点的 FASTA cgMLST	minimap2	吞吐量最好，加速机制丰富
分歧较大的组装结果	nucmer	对远缘等位基因更敏感
先快跑一遍，再对少量样本确认	minimap2 或 kma，之后用 blastn	先抓吞吐，再做保守复核

简单决策流程

1. 输入是 FASTQ 吗？
2. 是，优先从 kma 开始。
3. 如果是 MLST，而且你明确想用 minimap2 的 FASTQ 验证路径，也可以用 minimap2。
4. 如果是 cgMLST FASTQ，CLI 仍会倾向规范到 KMA。
5. 输入是 FASTA 组装结果吗？
6. 追求大型 cgMLST 吞吐量，用 minimap2。
7. 想走保守参考路径，用 blastn。
8. 如果物种或等位基因差异明显偏大，优先试 nucmer。

性能建议

• -t/--threads 对 minimap2 和 blastn 有效。kma 和 nucmer 的单样本比对无法利用多线程（实测 -t 1 与 -t 16 无差别），对这两个后端只能靠样本级并行提速。
• 批量处理很多样本时，用 --max-workers N（N 取 CPU 核心数）做样本级并行；--max-workers > 1 时每样本的后端线程会强制为 1。
• 639 个组装、16 workers 实测：minimap2 55 s → 9 s、blastn 97 s → 31 s、nucmer 270 s → 76 s、kma 330 s → 48 s。
• 大型 FASTA cgMLST 可以先用 minimap2 跑主流程，只对标记位点或标记样本做回退确认。
• FASTQ cgMLST 配合 KMA 时，除非在调试，否则尽量不要长期使用单 worker。
• 大批量任务建议用 -o 把输出直接写到文件，而不是全部打到终端。
• 重复任务尽量复用已缓存的方案和索引，第一次建索引会慢一些，之后会轻很多。
• 临时空间较慢或较小的时候，可以用 GMLST_TMPDIR 把临时文件放到更合适的位置。

FASTQ 专题说明

双端自动识别

gmlst 会自动识别常见的双端 FASTQ 命名：

• sample_R1.fastq.gz + sample_R2.fastq.gz
• sample_1.fq.gz + sample_2.fq.gz
• sample.1.fastq.gz + sample.2.fastq.gz

示例：

gmlst typing mlst -s saureus_1 -b kma reads/sample_R1.fastq.gz reads/sample_R2.fastq.gz

k-mer 支持打分

对于 minimap2 FASTQ 分型，GMLST_MINIMAP2_KMER_ENGINE 控制打分引擎：

• python，内置打分器
• kmc，使用 KMC/KMC tools
• auto，优先使用 KMC，否则回退 Python

定向验证

minimap2 的 FASTQ 模式不是单次映射就结束。它会先构建候选等位基因，再做支持打分，然后对不确定位点做定向重映射验证。所以它适合想要高速筛选，同时又不想完全放弃后续确认的场景。

Nanopore（ONT）读长

ONT 读长与其他 FASTQ 输入一样走 KMA 路径。基于与配套混合组装（霍乱弧菌与副溶血弧菌，R10.4/Q20+ 数据）的实测验证：

• 经典 7 基因座 MLST 大部分可直接从 reads 调用：7 个基因座中 5-6 个精确匹配，其余以最接近（~n）调用报告，而非错误的精确调用。
• 单基因座翻转可能发生：甲基化位点碱基识别错误（ONT 已知伪影，原生 DNA 文库尤其明显）可能使某个等位基因编号在重复运行或与组装真值比较时发生变化。reads 与组装结果之间的单基因座差异，在确认是生物学差异之前应保持怀疑。
• 我们测试了 KMA 的 -bcNano 模式但未启用：在 Q20+ 验证对上输出与默认模式完全一致——它针对缺失型误差，而甲基化误差是替换型。

建议：

• 需要权威 ST 结论时，先组装（如 Flye + Medaka），再对组装 FASTA 走常规分型路径。
• reads 直接分型适合快速筛查；对 novel 或低置信调用用 --format json 的分数复核或做定向二次分析。
• 不建议对 ONT reads 不经组装直接做 cgMLST——误差会在数千个基因座上累积。

相关调用类型

虽然不同后端的取证路径不同，但最终每个位点的调用都会落到同一套五类结果中：

调用类型	判定规则
exact	identity 100%，coverage >= 1.0
closest	identity >= 95%，coverage >= 0.95
novel	coverage >= 0.95，identity < 95%
partial	coverage > 0 且 < 0.95
missing	没有匹配