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物种鉴定模式

分层架构

gside 的鉴定按证据强度分层，高层优先于低层（记录不致命）：

L3  gtdbtk（GTDB-Tk 系统发育 placement）      [layer=3]
L2  panel skani / mash_refseq / sourmash    [layer=2]
L1  marker 靶基因组合规则                    [layer=1]

L1: marker（靶基因组合）

原理

对 contigs 执行一次 BLAST（vs markers 库，81 条序列），将命中基因与 38 条组合规则匹配（数据驱动，marker_rules.yaml）。

判定阈值

门槛 值 说明
全局最低一致性 85% 低于此值的命中不计入
全局最低覆盖率 60% 防短 HSP 高一致性误报
高置信分界 平均一致性 90% 命中基因平均一致性 ≥90% 时 confidence=high，低于则为 medium

规则机制

- species: Campylobacter_jejuni
  genes: [mapa, hipo, cadf]     # 候选标记
  min_hits: 2                     # 至少命中 2 个
  min_identity: 90                # 每个基因 ≥90% 一致性
  exclude_genes: [ceue]           # 排除守卫：ceuE 存在 → 倾向 C_coli

交叉反应防护

  • exclude_genes：排除规则防止近缘种误判（如 C.jejuni vs C.coli）
  • tlh 近缘守卫：单基因 <90% 命中 → 判定抑制为 Unknown（V.alginolyticus 案例）
  • coverage 门槛：全局 ≥60%（防短 HSP 高一致性误报）

适用场景

  • 快速初筛（分钟级）
  • 无需大数据库（mini tier 内置）
  • 近缘种丰富的属（沙门菌/大肠/弯曲菌等）需配合 L2 确认

L2: panel（ANI 精选面板）

原理

skani 对 contigs 与精选参考面板（291 基因组，30 启用物种）做全基因组 ANI 比对。

判定阈值

ANI aligned_fraction 判定
≥95% ≥0.65 species=命中参考基因组的物种，confidence=high
93~95% ≥0.65 confidence=medium（建议复核）
<93% 无 Unknown

适用场景

  • 精确物种确认（亚种级分辨率）
  • 近缘种区分（marker 层无法判别时）
  • 需 panel tier 数据库（~130MB）

L2: mash_refseq（MinHash 距离）

原理

mash 对 contigs 与 RefSeq 全库 sketch（mash.msh，~179MB）做 MinHash 距离估算。

判定阈值

mash 相似度（1 - 距离） 判定
≥0.97 物种判定，confidence=high
0.90~0.97 confidence=medium（建议复核）
<0.90 Unknown

适用场景

  • 广谱筛查（覆盖 RefSeq 全部原核生物）
  • 快速（秒级）
  • 精度低于 panel ANI（MinHash 是估算）

L2: sourmash（GTDB gather）

原理

sourmash gather 对 contigs 做 LCA 分类，基于 GTDB 分类框架。

判定阈值

匹配比例 判定
≥0.90 confidence=high
0.70~0.90 confidence=medium（建议复核）
<0.70 Unknown

gather 分解出多个显著匹配成分时，结果携带 possible_mixture 提示。

适用场景

  • 需要与 GTDB 分类体系对齐时
  • 混合样本（gather 可分解）
  • 需下载 sourmash GTDB 库

L3: gtdbtk（GTDB-Tk 系统发育 placement）

原理

GTDB-Tk classify_wf 将组装放入 GTDB 参考树 （classify_wf --genome_dir ... --out_dir ... --database $GTDBTK_DATA_PATH）。 分类串从 gtdbtk.bac120.summary.tsv 解析（回退 gtdbtk.ar122.summary.tsv）， 物种名取最后一个 s__ 位阶。

判定阈值

分类串 判定
含 s__ 位阶 提取物种名，confidence=high（权威）
无 s__ 位阶 Unknown，confidence=low

GTDB-Tk 视为最高权威层：gtdbtk 的判定优先于任何 L2 ANI/MinHash 判定， 与低层置信度无关。

依赖

  • 外部安装的 GTDB-Tk（gside db setup 不负责安装）：PATH 中的 gtdbtk 二进制 + 通过 GTDBTK_DATA_PATH（或 GTDBDB）指定的参考库——见 https://ecogenomics.github.io/GTDBTk/
  • 较慢：每基因组分钟级（MAFFT + pplacer）；可用 -t/--threads 提线程

适用场景

  • 需要 GTDB 树上的权威物种判定
  • 裁决 L1/L2 方法之间的分歧
  • 论文级分类学指定

all 模式（多法仲裁）

运行全部 5 种方法（marker + panel + mash_refseq + sourmash + gtdbtk）， 按层级仲裁取最优：

L3（gtdbtk）优先于 L2（panel/mash_refseq/sourmash）优先于 L1（marker）：
先比较层级，再比较置信度。

单个方法失败不会终止整体流程，错误信息写入该方法结果 （methods.<mode>.error）。缺库错误额外携带结构化字段 （missing_tier、suggested_command、estimated_size）；加上 --auto-setup 后 gside 会自行安装该 tier 并对该方法重试一次。

gtdbtk 包含在 all 内但较慢（每基因组分钟级）——追求速度时请显式 指定 -m 跳过。

gside species contigs.fna --mode all

输出包含所有方法结果 + 最终 verdict：

{
  "verdict": {
    "species": "Campylobacter jejuni subsp. jejuni NCTC 11168",
    "confidence": "high",
    "basis": ["panel"]
  },
  "methods": {
    "marker": { "species": "Campylobacter_jejuni", ... },
    "panel": { "result": { "species": "...", "ani": 100.0, ... } },
    "mash_refseq": { "result": { "species": "...", ... } },
    "sourmash": { "result": { "species": "...", ... } },
    "gtdbtk": { "result": { "species": "...", "classification": "...", ... } }
  }
}

方法选择建议

场景 推荐 mode 理由
快速初筛 marker 最快，零外部依赖
精确鉴定 panel ANI 金标准
广谱筛查 mash_refseq 覆盖全 RefSeq
GTDB 体系对齐 sourmash LCA 分类，可提示混合样本
权威 placement gtdbtk GTDB 树系统发育 placement（慢）
综合判定 all 多法互补 + 仲裁
近缘种区分 panel 或 all marker 可能交叉反应

宏基因组谱分析（gside meta）

混合群落样本可使用 gside meta 做分类学谱分析。详见 宏基因组谱分析。

模式 引擎 输入 置信度依据
kraken2 Kraken2 + Bracken FASTQ / FASTA Bracken 丰度（≥10% high，≥1% medium）
sylph sylph 仅 FASTQ Adjusted ANI（≥95 high，≥93 medium）
all 双引擎 FASTQ / FASTA 合并谱